Q:如何保存合成的多肽?
A:多肽在-20℃很穩定,特別是冷凍干燥并保存在干燥器中,在將它們暴露于空氣之前,冷凍干燥多肽可以放于室溫。這將是濕度影響減少,當無法冷凍干燥時,最好的方法是以小的工作樣量存放!
對于含Cys, Met orTrP的多肽,脫氧緩沖劑對其溶解必不可少,因為這種多肽可易空氣氧化,在封瓶前,慢慢流過多肽的氮氣或氬氣也會降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解,所有這些肽與不含這些有問題解苷的那些肽相比,生命期有限。
Q:多肽的溶解性怎樣?都溶于哪些溶劑?
A:大多數肽的首選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對于堿性或酸性多肽的溶解很重要。這些方法不溶的多肽,需要DMF(二甲基甲酰胺)、脲、guanidinium(胍鹽)、chloride(氯化物)或acetonitrile(乙腈)來溶解,這些溶劑可能某些實驗有副作用。所以設計多肽時要加注意。
殘基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val將全增加多肽的溶解難度!
Q:多肽的保存如何操作?
A:包裝1mg或更少的多肽按凈重包裝,聲明的小瓶重不含相關抗離子和水。例如,氨基酸分析決定的肽含量是80%,在1mg樣品中,那么瓶中毛重是1.25mg。
大量的多肽以毛重算。標出的重量含相關抗離子和水,例如,25mg樣品中肽百分比為90%,那么,實際肽量為25mg×90%=22.5mg 不要把肽含量和純度搞混了。肽的純度可能是100%,而肽含量相關帶電基團(如Arg, Lys )的抗離子量和肽親水性決定。這是合成肽的本身特性。
所有產品應存于冰箱,最好為-20℃。多數肽以此方法可以存放幾年不變! ∪芤弘倪h比凍干形式不穩定,溶液應為中性pH(pH5-7), -20℃保存的,為避免樣品的反復凍融,最好分成小樣存放。一份樣品融凍后未用完,應扔掉,細菌降解有時會成為溶液肽的麻煩,為克服此,肽應溶于無菌水,或肽溶液用0.2μ M濾膜過濾。
Q:如何重建多肽重建過程如何操作?
A:多數肽溶于無菌蒸溜水。初次溶解時,要注意使初始濃度比要求濃度大,如果多肽僅有限溶解性,這便允許加入其它溶解劑或緩沖鹽。如果多肽在水中的溶解性有限,有幾種選擇可幫助溶解: 對堿性肽用稀乙酸(含Arg , Lys , His) 酸性肽用稀氨水(含Asp, Glu) 對極疏水的肽用10%有機修飾物(acetonitrile , Methanol) 極不溶的肽用DM50或DMF guanidine hydrochloride或脲的濃溶液也很有用,與上述方法合用,聲處理也是溶解多肽的有效手段。
Q:HPLC分析是什么?如何利用HPLC純化多肽
A:分析HPLC使用柱子和泵系統,可以經受傳遞高壓,這樣可以用極細的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。
HPLC分兩類:離子交換和反相。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用,通過可變PH,離子強度,或兩者洗脫出多肽,通常,先用低離子強度的溶液,以后逐漸加強或一步一步加強,直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上,用降低離子強度洗脫,如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成,這種鏈長度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的,高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。然而,總體實踐中,這兩類柱互變無多少顯著差別,別類載體由碳水化合物構成,比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m).。大量各種緩沖劑含許多不同試劑,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸,稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨,TFA/TEA,磷酸鈉或鉀,異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑,但要注意一點:硅反相柱料不能長時間暴露于高pH,甚至微堿pH,因為這樣會破壞柱子。
Q:如何保存合成的多肽?
A:多肽在-20℃很穩定,特別是冷凍干燥并保存在干燥器中,在將它們暴露于空氣之前,冷凍干燥多肽可以放于室溫。這將是濕度影響減少,當無法冷凍干燥時,最好的方法是以小的工作樣量存放!
對于含Cys, Met orTrP的多肽,脫氧緩沖劑對其溶解必不可少,因為這種多肽可易空氣氧化,在封瓶前,慢慢流過多肽的氮氣或氬氣也會降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解,所有這些肽與不含這些有問題解苷的那些肽相比,生命期有限。
Q:多肽的溶解性怎樣?都溶于哪些溶劑?
A:大多數肽的首選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對于堿性或酸性多肽的溶解很重要。這些方法不溶的多肽,需要DMF(二甲基甲酰胺)、脲、guanidinium(胍鹽)、chloride(氯化物)或acetonitrile(乙腈)來溶解,這些溶劑可能某些實驗有副作用。所以設計多肽時要加注意。
殘基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val將全增加多肽的溶解難度!
Q:多肽的保存如何操作?
A:包裝1mg或更少的多肽按凈重包裝,聲明的小瓶重不含相關抗離子和水。例如,氨基酸分析決定的肽含量是80%,在1mg樣品中,那么瓶中毛重是1.25mg。
大量的多肽以毛重算。標出的重量含相關抗離子和水,例如,25mg樣品中肽百分比為90%,那么,實際肽量為25mg×90%=22.5mg 不要把肽含量和純度搞混了。肽的純度可能是100%,而肽含量相關帶電基團(如Arg, Lys )的抗離子量和肽親水性決定。這是合成肽的本身特性。
所有產品應存于冰箱,最好為-20℃。多數肽以此方法可以存放幾年不變! ∪芤弘倪h比凍干形式不穩定,溶液應為中性pH(pH5-7), -20℃保存的,為避免樣品的反復凍融,最好分成小樣存放。一份樣品融凍后未用完,應扔掉,細菌降解有時會成為溶液肽的麻煩,為克服此,肽應溶于無菌水,或肽溶液用0.2μ M濾膜過濾。
Q:如何重建多肽重建過程如何操作?
A:多數肽溶于無菌蒸溜水。初次溶解時,要注意使初始濃度比要求濃度大,如果多肽僅有限溶解性,這便允許加入其它溶解劑或緩沖鹽。如果多肽在水中的溶解性有限,有幾種選擇可幫助溶解: 對堿性肽用稀乙酸(含Arg , Lys , His) 酸性肽用稀氨水(含Asp, Glu) 對極疏水的肽用10%有機修飾物(acetonitrile , Methanol) 極不溶的肽用DM50或DMF guanidine hydrochloride或脲的濃溶液也很有用,與上述方法合用,聲處理也是溶解多肽的有效手段。
Q:HPLC分析是什么?如何利用HPLC純化多肽
A:分析HPLC使用柱子和泵系統,可以經受傳遞高壓,這樣可以用極細的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。
HPLC分兩類:離子交換和反相。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用,通過可變PH,離子強度,或兩者洗脫出多肽,通常,先用低離子強度的溶液,以后逐漸加強或一步一步加強,直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上,用降低離子強度洗脫,如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成,這種鏈長度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的,高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。然而,總體實踐中,這兩類柱互變無多少顯著差別,別類載體由碳水化合物構成,比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m).。大量各種緩沖劑含許多不同試劑,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸,稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨,TFA/TEA,磷酸鈉或鉀,異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑,但要注意一點:硅反相柱料不能長時間暴露于高pH,甚至微堿pH,因為這樣會破壞柱子。
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