1.堿基序列對全基因合成的影響
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長片段重復。大量的長片段重復很可能會延長基因合成的時間,甚至導致基因完全無法合成。
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高GC%;騼炔康木植扛逩C%會嚴重影響PCR擴增和測序。
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二級結構。堿基序列的反轉、重疊等會嚴重影響PCR擴增,在測序時也可能會因此而測不通或信號突然中斷等。
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測序引物與基因內部的特殊序列結合導致無法正常測序,必須重新設計測序引物。
對策: 對密碼子進行優化,盡量減少基因序列中的重復序列,高GC%區和二級結構區。
2.PCR出現非特異性擴增帶
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引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
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Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多。
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酶量過多出現非特異性擴增。
對策:
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重新設計引物。
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減低酶量或調換另一來源的酶。
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降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。
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適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。
3.PCR出現片狀拖帶或涂抹帶
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酶量過多或酶的質量差。
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dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多。
對策:
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減少酶量,或調換另一來源的酶。
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減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度,減少循環次數。
4. DNA沒有被限制性內切酶切開或者切割不完全
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缺少識別序列。
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反應條件不合適。
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限制性內切酶對DNA甲基化敏感。
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內切酶稀釋不正確或加入方法不正確。
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甘油濃度過高。
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限制性內切酶已部分或全部失活。
對策:
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檢查底物DNA中是否存在可被限制酶識別的DNA序列。
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使用隨酶提供的反應緩沖液;增大酶量。
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檢查DNA是否已被甲基化以及所用的限制性內切酶是否對甲基化敏感。
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限制性內切酶經稀釋緩沖液稀釋后應在當天用完;限制性內切酶通常在最后加入。
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更換新酶進行實驗。
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酶的體積不能超過反應總體積的1/10。
5.電泳后電泳條帶擴散,電泳條帶移動距離異常
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底物DNA不純。
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限制性內切酶不純。
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酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結合在一起使電泳條帶移動距離異常。
對策:
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用另外一種限制性內切酶與底物DNA溫育作為對照
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用產品說明中的底物DNA來檢測酶活性,如果電泳后條帶仍擴散,說明不正確的操作已使內切酶污染。
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電泳前用終濃度為0.1%的SDS在65℃與底物DNA溫育10min。
6.連接效率不高
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連接緩沖液已變質。
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限制性內切酶在連接混合物中仍具活性。
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非特異性的核酸酶污染。
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連接酶濃度太低。
對策:
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用新鮮的連接緩沖液重新進行連接反應。
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如果限制性內切酶在65℃溫育下熱穩定,酶切后應該用酚來去除去蛋白并用乙醇沉淀DNA。
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判斷連接反應混合物中哪種組分被污染,然后逐一將其替換。
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在連接反應中增大連接酶的用量(0.3-0.6 Wu/1μg),并同時使用10%PEG。酶切后用酚抽提底物DNA中的蛋白。
7.質粒及其菌株的運輸保存
在運輸過程中,質粒、甘油菌和穿刺菌均須保證低溫運輸。在實驗室內,穿刺菌應在0~4℃保存;甘油菌應在-70℃以下保存;質粒應在-20℃以下保存,并盡量避免反復凍溶。
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